Cloranfenicol 95

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cloranfenicol acetiltransferasa como marcador de selección para la transformación por clamidia Chlamydia Resumen Antecedentes es un patógeno bacteriano común responsables de muchas enfermedades. Los métodos para transformar este importante organismo utilizando una lactamasa como marcador de selección se han desarrollado muy recientemente. Sin embargo, los Institutos Nacionales de Salud directrices para la investigación con moléculas de ADN recombinante no permiten experimentos de transformación con vectores que contienen el gen de betalactamasa ciertos patógenos humanos clamidias. Por lo tanto, se necesita urgentemente un marcador de selección diferente para la transformación de esos clamidias. Resultados Después de transformación de plásmido libre de Chlamydia trachomatis con pGFP: SW2, que lleva una lactamasa y un gen de cloranfenicol acetiltransferasa fusionado a un gen de la proteína de fluorescencia verde, los transformantes se obtuvieron por selección con ampicilina o cloranfenicol. Estable resistente a cloranfenicol, pero sensible a la ampicilina, los transformantes se obtuvieron utilizando un pGFP: derivado SW2 sin el lactamasa. Todos los transformantes expresan la proteína de fluorescencia verde y habían restaurado la actividad de la síntesis de glucógeno. Conclusiones resistencia cloranfenicol puede ser utilizado como un marcador de selección para los experimentos genéticos en Chlamydia. Esto elimina el requisito para el uso de b-lactamasa, de los cuales la difusión en cierta C. serovares trachomatis pueden poner en peligro el tratamiento clínico de las infecciones por clamidia en mujeres embarazadas. cloranfenicol acetiltransferasa también puede servir como un marcador de selección secundaria útil para análisis genéticos en las cepas de clamidias-betalactamasa transformado. Palabras clave Chlamydia trachomatis Chlamydia cloranfenicol acetiltransferasa cloranfenicol infecciones de transmisión sexual Transformación La transformación selección Chlamydia marcador de fondo es una bacteria que se replica sólo en el interior de una célula huésped eucariota, y es un agente causante de una serie de enfermedades humanas 1. 2. Adquirida por transmisión sexual, la replicación de Chlamydia trachomatis en el tracto genital inferior hace que la cervicitis 1. Posteriormente, las clamidias ascender al tracto genital superior, causando la inflamación que conduce a la interrupción del tejido y la cicatrización en el útero y los oviductos. La inflamación en el útero durante el embarazo puede provocar aborto y el parto prematuro, mientras que la patología del oviducto por clamidia constituye la principal causa de infertilidad femenina, embarazo ectópico y 1. Por otra parte, un bebé de una madre infectada puede adquirir el patógeno al pasar el canal del parto, y desarrollar una infección respiratoria 1. C. la neumonía es un patógeno común de infección respiratoria adquirida en la comunidad, y un co-factor para la arteriosclerosis y la aparición tardía de la enfermedad de Alzheimer 3 5. En la actualidad, no existe una vacuna eficaz contra las enfermedades por clamidias humanos u otros medios de prevención están disponibles 6. 7. Chlamydia tiene un ciclo de desarrollo único, que consiste en dos formas celulares alterna: el cuerpo infecciosa pero que no se dividen elemental (EB), y el medio cuerpo reticulado pero no infecciosa (RB). eventos de desarrollo, incluyendo la conversión de EB en RB, la replicación de los RB, RB y reorganización de EB se llevan a cabo dentro de una vacuola inclusión designado citoplasma. Durante un largo periodo de tiempo, el estudio de Chlamydia se ha visto gravemente obstaculizada por la falta de un sistema genético conveniente. Afortunadamente, un método para transformar C. trachomatis con vectores lanzadera utilizando CaCl 2 se ha desarrollado muy recientemente por Wang et al. 8, y ha sido adoptada por otros 9. 10. Además, Gérard et al. han transformado C. pneumoniae utilizando dendrímeros como una herramienta de entrega 11. Ambos métodos se establecieron con plásmidos que llevan un lactamasa, que degrada los antibióticos de la familia de la penicilina, y por lo tanto alivia sus efectos inhibidores de estos fármacos en la citocinesis de RBs 8. 9. Desde la amoxicilina, un miembro de familia de la penicilina, se recomienda para el tratamiento de la cervicitis por clamidia en las mujeres embarazadas, los experimentos de transformación usando marcador lactamasa de patógenos de transmisión sexual, por clamidias no LGV (es decir, C. Trachomatis serovar D a K), no están permitidas por la Institutos nacionales de Salud para la Investigación en la que las moléculas de ADN recombinantes. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de identificar marcadores de selección para los estudios de recombinación en los serovares clamidias. Además, también hay una necesidad de identificar marcadores de selección secundaria para clamidias que ya pueden llevar un marcador resistente establecido tal como una lactamasa por diferentes razones en futuros estudios. A continuación, se presenta la identificación de un gen de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) como marcador de selección útil. Métodos Cultivo de Tejido y los reactivos de biología molecular de Dulbecco modificado medio Eagles (DMEM) con alta glucosa (4,5 g / L) y 110 mg / piruvato de sodio L, suero fetal bovino (FBS), de Dulbecco de solución salina tamponada con fosfato (PBS), tripsina-EDTA solución para el cultivo celular, base de Trizma, cicloheximida, CaCl2. ampicilina, cloranfenicol y solución de Lugol se adquirieron de Sigma Aldrich. Gentamicina y células stbl2 Escherichia coli competentes para la transformación se adquirieron de Invitrogen. Pfu polimerasa Ultra ADN se adquirió de Agilent. Bam H1 y el Site-Directed Mutagenesis Kit Q5 se adquirieron de New England Biolabs. Vectores pGFP :: SW2 es un vector lanzadera que contiene un E. origen coli de replicación, un gen de lactamasa, un gen de cloranfenicol acetiltransferasa fusionada a ADN que codifica una proteína de fluorescencia verde desplazada al rojo (GFP), y casi la secuencia completa de una C. trachomatis plásmido designado SW2 (Figura 1. superior) 8. pGFP-CAT :: SW2 (Figura 1. inferior) se obtuvo por deleción del gen de lactamasa de pGFP :: SW2. Brevemente, el ADN SW2 pb 7169 se eliminó a partir del plásmido amplificando primero la secuencia de ADN no clamidias utilizando la polimerasa Pfu Ultra ADN y un par de cebadores complementarios entre sí, GFP-5c (5TAGATTAATGTCGACTCTAGAGGATCCGGGTACCGAGCTCGAA3) y GFP-3c (5TTCGAGCTCGGTACCCGGATCCTCTAGAGTCGACATTAATCTA3), que orientar los extremos de los fragmentos de ADN no clamidias y, a continuación, circularización del fragmento en e. coli. Del mismo modo, el sitio Bam H1 dentro de la secuencia de GFP del plásmido 4.370 pb codificación resultante, designado pBETA-GFP-CAT, se inactivó usando los cebadores complementarios entre sí GFP-del-BamH1-5c (5AAGCCGATATGGTGGATTCCCGGGTACCAATGA3) y GFP-del-BamH1-3c (5TCATTGGTACCCGGGAATCCACCATATCGGCTT3). El marco de lectura abierto lactamasa 861 pb se eliminó del plásmido utilizando el Q5 Site Directed Mutagenesis Kit para producir el plásmido pGFP-CAT. Los cebadores para la mutagénesis mediada por Q5 fueron Del-AMP1 (5CTGTCAGACCAAGTTTAC3) y Del-AMP2 (5ACTCTTCCTTTTTCAATATTATTG3). Finalmente, el fragmento de 7168 pb SW2 se insertó en el sitio Bam H1 de la pGFP-CAT para producir pGFP-CAT: SW2 (Figura 1). El cloranfenicol se utilizó para seleccionar E. coli transformada con pGFP-CAT y pGFP-CAT: SW2 (Figura 1). Secuencia de la autenticidad de la parte SW2 de pGFP-CAT :: SW2 se confirmó a través del servicio de pago proporcionada por Macrogen EE. UU.. Presentación esquemática de pGFP :: SW2 (arriba) y su derivado 8 pGFP-CAT :: SW2 (parte inferior). Secuencia originó a partir de la C. SW2 trachomatis plásmido se muestra en las secuencias de color rojo, y no por clamidia en negro. En comparación con pGFP :: SW2, el gen de lactamasa se ha eliminado y un sitio de corte Bam H1 situado aguas arriba del gen de fusión GFP-CAT ha sido inactivado en pGFP-CAT :: SW2. El resto de características, incluyendo el C. trachomatis origen de replicación del plásmido (PSW2 ori) y las secuencias de codificación (CDS) 1-8, E. coli pUC origen de replicación (ori de pUC), el gen de fusión GFP-CAT y el promotor meningitidis Neisseria (NMP) que impulsa la expresión de GFP-CAT, se mantienen sin cambios en pGFP-CAT :: SW2. Métodos para ver detalles de la construcción. El ADN del plásmido preparación E. Se utilizaron células de E. coli stbl2 crecer plásmidos. El ADN de plásmido se purificó usando columnas de purificación de ADN Qiagen Midi, precipitada por etanol y se redisolvió en 10 mM Tris-HCl (pH 8,5). la concentración de ADN de las preparaciones finales fue 2,5 g / l o superior. células de células y condiciones de cultivo HeLa y McCoy se adquirieron de la American Type Culture Collections (ATCC, Manassas, VA), y se mantuvieron como cultivos adherentes en 5 incubadoras de CO 2 con 100 humedad utilizando DMEM que contenía FBS al 10 8. Se prepararon preparación de EB que los OC de transformación para experimentos de transformación como se ha descrito previamente 8 con modificaciones menores. Cinco frascos T150 de células HeLa confluentes 95 se inocularon con un stock de EB del plásmido libre C. trachomatis 2566R (L2R) 12 a una multiplicidad de 5 unidades formadoras de inclusión (IFU) por célula, y se cultivaron con medio que contiene 20 g / ml de gentamicina y 1 g / ml de cicloheximida. 46 h después de la inoculación, las monocapas infectadas en cada matraz se enjuagaron brevemente con 5 ml de PBS, y 3 ml de tripsina-EDTA. Cuando las células parecían haber redondeado bajo un microscopio invertido, que se recogieron en 8 ml de DMEM-FBS. Las células de los 5 matraces se combinaron, y se sometieron a centrifugación a 500 g durante 10 min. Después de la eliminación del sobrenadante, las células se resuspendieron en 1 ml de tampón de SPG 13 y se rompieron mediante tres ciclos de 5-s en / 5-s sonicación de usar un procesador de Sonic ultrasónico (número de modelo: GEX 130) equipado con un 3-mm micropunta diámetro escalonado. El nivel de intensidad de energía del aparato de ultrasonidos se fijó en 40 14. El lisado celular se centrifugó a 750 g durante 10 min. Las alícuotas del sobrenadante, que contenía EBs, se hicieron y se almacenaron a -80ºC. El título de este lote de EB social se determinó que era 2 10 9 IFU / ml. Transformación y selección de transformantes La transformación se llevó a cabo como se describió previamente 8 con modificaciones. 7,5 l del congelado L2R EB arriba mencionado se combinó con 10 g de ADN plasmídico en 3,5 l de volumen y 189 l mM CaCl 2 tampón 50 (preparado con Tris 10 mM, pH 7,4) en un tubo de 1,5 ml, que se dejó reposar a temperatura durante 40 a 45 min. se tripsinizaron células McCoy de una cultura 20 h a 80 de confluencia en una placa de 145 mm de diámetro, se recogió en 14 ml de antibiótico libre de DMEM-FBS, y se centrifugaron a 500 g durante 5 min. Después de la eliminación del sobrenadante, el sedimento celular se lavó suavemente con 10 ml de PBS, se resuspendieron con 14 ml de PBS, y se centrifugó de nuevo. El sedimento se resuspendió en 220 l CaCl 2 buffer. 200 l de la suspensión celular se añadió a continuación en el plásmido 2 mix-EB-CaCl. La mezcla de transformación final se incubó a temperatura ambiente durante 20 min, durante el cual el tubo se agitó de vez en cuando para evitar la sedimentación de las células. Al final del periodo de incubación 20 min, las células se diluyeron con 20 ml de DMEM-FBS, y se sembraron en cuatro matraces T25 (5 ml / frasco) y se cultivaron a 37ºC bajo 5 CO 2 y 100 de humedad. La selección de transformantes se inició 10 h después de la placa inicial de la transformación. La ampicilina y cloranfenicol se añadieron a los cultivos para dar una concentración final de 2 g / ml y 0,1 g / ml, respectivamente. Este pasaje inicial se define como el paso 1. 46 h más tarde, se recogieron las células en los matraces T25 y se rompieron por sonicación. La totalidad de la cultura P1 se pasó a un nuevo matraz T25 de células McCoy a 80-90 confluencia. Los matraces P2 se cultivaron con DMEM-FBS que contiene 1 g / ml de cicloheximida, más 5 g / ml de ampicilina o 0,2 g / ml de cloranfenicol. El paso y la selección se repitieron cada 48 h para dos pases adicionales a través del paso se congeló 4. 90 la cosecha de paso 4 y el restante se amplió con un medio que contenía 5 g / ml de ampicilina o 0,5 g / ml de cloranfenicol. mancha glucógeno para teñir glucógeno en inclusiones clamidias, el medio de cultivo se reemplazó con solución de Lugol, que contiene yodo, a las 40 h después de la inoculación. adquisición de imágenes y procesamiento de todas las imágenes de contraste de fase y GFP se obtuvieron a las 40 horas después de la inoculación de cultivos vivos en PBS suplementado con 1,3 mM de CaCl2. 1,0 mM de MgCl 2 y 1,0 g / L (w / v) de glucosa utilizando una Olympus IX-51 microscopio y una cámara CCD monocromo de Olympus. Procesamiento de imágenes (coloración y superposición de colores) se llevaron a cabo utilizando el software Picture Frame 15. 16. Resultados y discusión pGFP :: SW2, el vector lanzadera construido por Wang et al, contenían un gen lactamasa como marcador de selección. También lleva un gen CAT que se fusiona con el gen GFP 8. Se encontró que E. coli transformadas con el plásmido pGFP :: SW2 fue capaz de crecer en medio que contenía cloranfenicol (concentración final: 170 g / ml), lo que sugiere que el gen CAT también puede ser utilizado como un marcador de selección para los experimentos de transformación por clamidias. Como advertido por Wang et al. un efecto adverso de cloranfenicol en las mitocondrias de acogida, como se demuestra por Li et al. 17 puede afectar a la utilidad de este antibiótico para la transformación por clamidia 8. En Li et al. s informe, la concentración tóxica mínima de cloranfenicol fue 10 g / ml, lo que causó una leve reducción 20 de la producción de ATP. Hemos determinado que la aparente concentración más baja que la formación de cloranfenicol inclusión inhibió completamente en el plásmido libre de C. cepa trachomatis L2 designado L2R fue sólo 0,05 g / ml (datos no mostrados), lo cual fue muy por debajo de las concentraciones tóxicas a las células huésped. Por lo tanto, razonó que este antibiótico se podría utilizar para seleccionar los transformantes que expresan CAT sin destacando significativamente células huésped. Hemos transformado L2R con pGFP :: SW2, y seleccionamos una media de las células transformadas con ampicilina, y la otra mitad con cloranfenicol. Se añadieron los antibióticos (2 g / ml de ampicilina o 0,1 g / ml de cloranfenicol) a los cultivos a 10 h después de la transformación. Comenzando en el paso 2, sus concentraciones se aumentó a 5 y 0,2 g / ml, respectivamente, y que se agregaron en el momento de la inoculación. La relación de división entre los pasajes se mantuvo 1: 1 del paso 1, aunque el paso 4. A pesar de que la CIM de cloranfenicol, que se determinó a baja multiplicidad de infección (0,1 unidades formadoras de inclusión por célula), fue 0,05 g / ml, algo de la se esperaba que las clamidias no transformadas para formar inclusiones en la presencia de 0,1 a 0,2 g / ml del antibiótico, porque se utilizó una alta EB a la celda relación de transformación, y la eficacia de la inhibición del crecimiento por clamidias por los antibióticos está influenciada por la multiplicidad de la infección 18. Con el protocolo anterior de selección descrito, en cultivos seleccionados con ampicilina, bajo un microscopio de contraste de fase, no se encontraron casi 100 células para contener una de inclusión con RBs aberrantes en el paso inicial. Las inclusiones que contiene RB-aberrantes todavía estaban presentes en una pequeña proporción de células en el paso 2, pero fueron sustituidos en su mayoría por inclusiones de apariencia normal, en el paso 3. inclusiones normales se encuentra en aproximadamente 20 células, y las inclusiones anormales rara vez se observan en el paso 4. en el paso 5, que resultó de la inoculación con 10 la cosecha del paso 4, las inclusiones se encontraron en 80 células aparentemente, ninguna de estas inclusiones contenía RBs aberrantes. Desde cloranfenicol no causa clamidias para formar aberrante RBS, que juzga la resistencia al antibiótico por el tamaño inclusión. se detectaron inclusiones de tamaños más pequeños de lo normal en casi todas las células en el paso 1. Algunos, pero de tamaño muy pequeño, las inclusiones se encontraron en el paso 2, y la mayoría de esas inclusiones fueron reemplazados con inclusiones de tamaño normal por el paso 3. normal inclusiones - sized se encontraron en más de 20 células en el paso 4. en el paso 5, derivado después de la inoculación con 10 paso 4 de la cosecha, y un aumento en la concentración de cloranfenicol (de 0,2 g / ml a 0,5 g / ml), inclusiones de tamaño normal fueron encontrados en casi 100 células 0000000. Además de la resistencia aparente a los agentes de selección, se utilizó la expresión de GFP y la restauración de la síntesis de glucógeno como marcadores adicionales para la transformación exitosa 8. 9. 19. EBs cosechadas de paso 5 se utilizaron para infectar células McCoy en una 1: tasa de dilución 100 (el número de células equivalencia) para los experimentos que determinan la expresión de GFP y la síntesis de glucógeno (Figura 2). Como era de esperar, ni de tipo salvaje plásmido repletos C. trachomatis L2 (434 / bu) (Figura 2 A) ni no transformada L2R libre de plásmidos (Figura 2 B) expresó GFP. De acuerdo con resultados establecieron que la síntesis de glucógeno en C. trachomatis requiere su plásmido 8. 9. 19. 20, mancha de yodo mostraron que el glucógeno se acumula en las inclusiones de tipo salvaje L2 (Figura 2 A) pero no las de L2R (Figura 2 B). En presencia de 5 g / ml de ampicilina, que inhibe la división RB, no transformada L2R (Figura 2 C) formado inclusiones que contienen RBs gigantes sin producir glucógeno, mientras que el cloranfenicol (concentración final: 0,5 g / ml) inhibió completamente la formación de inclusiones visibles L2R en las células infectadas (Figura 2 D). En consonancia con los datos publicados por Wang et al. 8, transformada-SW2 pGFP :: L2R seleccionaron con ampicilina inclusiones positivas para GFP formadas con glucógeno (Figura 2 E). pGFP :: transformado-SW2 L2R selecciona con cloranfenicol inclusiones positivas para GFP también formados que contienen glucógeno (Figura 2 F). Como se esperaba, los transformantes seleccionados a la ampicilina fueron capaces de formar de tamaño normal, GFP-positivas, inclusiones en la presencia de cloranfenicol que contiene glucógeno (Figura 2 G) del mismo modo, transformantes seleccionados al cloranfenicol eran completamente resistentes a la ampicilina, expresan GFP y producidos glucógeno (Figura 2 H). Estos resultados sugieren que el gen CAT en el plásmido pGFP :: SW2 es funcional en las clamidias, y la resistencia al cloranfenicol se puede utilizar como un marcador de selección para la transformación por clamidias. La inclusión, la expresión de GFP y la síntesis de glucógeno de los transformantes pGFP :: SW2 de C. trachomatis L2. Sin transformar la cepa 434 / bu-plásmido repleta (A). untranformed cepa sin plásmido L2R (B-D). y transformado L2R seleccionado, ya sea con ampicilina (E, G) o cloranfenicol (F, H) se cultivaron bien con medio que contiene un medio libre de antibiótico antibiótico o con indicado. Imágenes de inclusiones en cultivos sin teñir y teñido con yodo fueron adquiridas con el microscopio de contraste de fase o microscopía de fluorescencia 48 h después de la inoculación. En todos los paneles, y las imágenes de contraste de fase GFP son superponibles. Seguidamente, retiramos el gen de lactamasa del plásmido pGFP :: SW2 como se describe en la sección Métodos, y utilizamos el pGFP-CAT resultante :: plásmido SW2 para transformar L2R. clamidias transformadas se sometieron a selección con cloranfenicol usando el mismo régimen como se describe anteriormente. inclusiones resistente al cloranfenicol surgieron en aproximadamente 20 de las células infectadas en el cultivo de paso 4. Microscopía de fluorescencia y yodo mancha reveló GFP y las inclusiones de glucógeno-positiva en las células que fueron infectadas con EBs cosechan del paso 5, y se cultivaron en la presencia de cloranfenicol (Figura 3. El panel superior). Sin embargo, como resultado de una falta de lactamasa en el pGFP-CAT :: plásmido SW2, los transformantes no fueron capaces de formar inclusiones normales en presencia de ampicilina en su lugar, sus inclusiones se llenaron de RBs aberrantes. Mientras que las inclusiones irregulares estaban siendo positivas para GFP, que eran en gran parte libre de glucógeno (Figura 3. El panel inferior). Después del paso 5, el pGFP-CAT :: transformantes SW2 se cultivaron con 0,5 g / ml de cloranfenicol durante cuatro pasajes adicionales en un 1: relación de división 100 para cada pasaje. Todas las inclusiones en el paso 9 tenían la misma apariencia que las inclusiones de clamidias plásmido repletas y no la de la L2R libre de plásmidos, y todos se encontraron para expresar GFP (datos no mostrados). Estos resultados demuestran que el gen CAT en el plásmido pGFP SW2-CAT ::, similar al plásmido pGFP :: SW2, funciona como un marcador de selección para C. transformación trachomatis. Inclusión. La expresión de GFP y la síntesis de glucógeno en L2R transformada con pGFP - CAT :: SW2. Las células infectadas con transformantes seleccionados al cloranfenicol fueron expuestas a cloranfenicol o ampicilina. Imágenes de inclusiones en cultivos sin teñir y teñido con yodo fueron adquiridas con el microscopio de contraste de fase o microscopía de fluorescencia 48 h después de la inoculación. de contraste de fase y GFP imágenes son superponibles. Cabe señalar que Tam et al. ha intentado anteriormente para desarrollar un sistema de transformación con el gen CAT como un marcador selectivo 21. En ese estudio, un vector lanzadera que contiene un gen CAT se electroporó en EBs de C. E trachomatis (cepa UW-5 / CX) y L2 (cepa 434 / BU). Aunque tanto el ARNm CAT y la actividad enzimática fueron detectables en los cultivos iniciales de clamidias transformado, los autores no para obtener transformantes estables después de la selección con cloranfenicol para 4 pasajes. Es importante señalar que ambas cepas electroporadas contienen un plásmido nativo que comparte el mismo origen de replicación con el plásmido recombinante utilizado para la transformación 21. Desde Wang et al. fueron capaces de obtener transformantes resistentes a la penicilina estables sólo de L2R, un plásmido libre C. trachomatis L2 variante, pero no la de tipo salvaje, el plásmido repletos 434 / Bu, bajo condiciones experimentales idénticas por lo demás 8, de forma retrospectiva, no es sorprendente que Tam et al. fallado para derivar clamidias resistente al cloranfenicol estable. Conclusiones Se ha demostrado que para el plásmido libre C. trachomatis L2R, cloranfenicol puede usarse para seleccionar los transformantes cuando se utiliza un vector lanzadera que lleva un gen CAT. Desde Wang et al en Europa eran capaces de seleccionar los transformantes de una cepa clínica de serovar F con penicilina 19, gen CAT debe ser un marcador de selección altamente útil y compatible con la ley para serovariedad F y otra C. serovares trachomatis para los que actualmente no se permite el uso de vectores transmisores de betalactamasa en los EE. UU.. Además, prevemos que el gen CAT también puede servir como un valioso marcador secundario para la realización de experimentos de reconocimiento de genes y otros experimentos genéticos, como en C. linfogranuloma cepas trachomatis que (se) ya han sido transformadas con un plásmido portador de b-lactamasa. Departamento de Farmacología abreviaturas, Escuela de Medicina de la Universidad de Nantong Referencias Schachter J: La infección y la epidemiología de la enfermedad. Biología Chlamydia intracelular, patogénesis. Editado por: Stephens RS. 1999, Washington DC: ASM Press, 139-169. Campbell LA, Kuo CC: Chlamydia pneumoniaean factor de riesgo para la aterosclerosis infecciosa. Nat Rev Microbiol. 2004, 2 (1): 23-32. 10.1038 / nrmicro796. PubMed Ver artículo Balin BJ, Gerard HC, Arking EJ, Appelt DM, Branigan PJ, Abrams JT, Whittum-Hudson JA, Hudson AP: Identificación y localización de Chlamydia pneumoniae en el cerebro de Alzheimer. 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